Ny CRISPR-Cas9-metode kan måske forbedre DMD-behandling

MDA: En variant af den normale Cas9 nuklease, som typisk anvendes til CRISPR-genredigering, skærer kun den ene DNA-streng og resulterer i færre uønskede effekter. Det har forskere udnyttet i et forsøg på at udvikle en mere effektiv terapi for Duchenne myskeldystrofi (DMD).

Flere forskere har forsøgt at udvikle terapier for DMD ved at korrigere sygdomsfremkaldende mutationer i dystrofin-genet ved hjælp af CRISPR-Cas9-genredigering. Denne proces forårsager DNA dobbeltstrengsbrud, og når cellen forsøger at sætte DNA-strengen sammen igen, opstår der som regel fejl. Disse fejl kaldes indels og indebærer, at enkelte DNA-baser tilføjes eller fjernes omkring reparationsstedet, så genet efterfølgende giver ophav til et muteret eller afkortet protein.

I en poster, som blev præsenteret ved denne uges MDA-konference i Nashville, USA, har forskere fra Yale University arbejdet med en variant af Cas9, som kun skærer den ene af DNA-kædens to strenge. Varianten, som kaldes Cas9 nickase, skaber således et såkaldt nick i stedet for et dobbeltstrengsbrud.

Forskerne arbejdede først med celler fra en patient med DMD forårsaget af en duplikation af exon 20-25. Cellerne blev transfekteret med Cas9-nickase og guide-RNA (gRNA) målrettet til at lave et nick i begge udgaver af det duplikerede exon 21. Som kontrol blev den almindelige Cas9 nuklease anvendt i stedet for nikasen. Effekten af genredigeringerne af dystrofin-genet blev efterfølgende vurderet ved RT-PCR af transskriberet mRNA, gensekvensering og histologisk farvning af dystrofin-proteinet.

Genredigeringsterapi

Forsøgene viste, at både nukleasen og nickasen var i stand til at redigere duplikationen ud af dystrofin-genet, så cellerne dannede vildtype mRNA og protein. Men kun nickasen gjorde dette fejlfrit og gav ikke ophav til celler med indels i dystrofin-genet.

I modsætning hertil medførte nukleasen indels med en frekvens på 91 procent. Dette forhold blev også afspejlet på mRNA-niveau, hvor nukleasen gav anledning til flere afkortede mRNA-transkripter, hvorimod sådanne slet ikke forekom i forbindelse med nickasen. I overensstemmelse med disse resultater viste de histologiske analyser, at dystrofin-proteinet blev dannet i celler, der var genredigerede både med nukleasen og nickasen, men ikke i uredigerede celler.

Forskerne gentog forsøget med en anden sygdomsfremkaldende duplikation i exon 7 med en gRNA rettet mod dette exon. Også i dette forsøg formåede nickasen at fjerne duplikationen, hvilket kunne ses både på DNA, mRNA og protein niveau, men den gjorde det mindre effektivt end nukleasen. Heller ikke i dette tilfælde medførte nickasen dannelse af indels, hvilket var tilfældet for nukleasen.

Forskerne kalder deres metode for 'single gRNA guided Cas9 nickase' (SGCN). De ved endnu ikke, hvordan SGCN - som jo ikke medfører dobbeltstrengsbrud i DNA-strengen - kan føre til, at duplikationerne i dystrofin-genet bliver skåret ud. Dette vil de nu undersøge, ligesom de vil afprøve om metoden også kan anvendes som mulig genredigeringsterapi mod andre duplikationer i dystrofin-genet eller i andre gener.